新(xīn)聞中(zhōng)心
來源：賽默飛電(diàn)子商(shāng)務(wù)平台
01
目标模闆濃度太低
在qPCR 中(zhōng)體(tǐ)現為(wèi)CT值偏大，複孔重複性不佳。
可(kě)能(néng)的原因1
基因表達豐度低
優化建議：選擇高靈敏度、熒光信号強、更寬動态範圍的qPCR試劑對付低豐度模闆；
可(kě)能(néng)的原因2
模闆稀釋過度
優化建議：提高模闆濃度(濃縮)，減少模闆稀釋度（理(lǐ)論上每稀釋10倍，CT 值大 3.3）；
可(kě)能(néng)的原因3
模闆有(yǒu)降解
優化建議：重新(xīn)制備模闆，注意選擇好的RNA純化Kit，避免RNA降解，優化逆轉錄條件。
02
擴增效率異常
擴增效率偏離100%±10% 應考慮優化。Ct值出現太晚的潛在原因之一是擴增效率低，導緻效率低的原因可(kě)能(néng)有(yǒu)
可(kě)能(néng)的原因1
反應條件未優化
優化建議：可(kě)以在同一實驗中(zhōng)預設不同退火溫度，選擇Ct值較小(xiǎo)且平台期熒光強度高的那個溫度；
可(kě)能(néng)的原因2
存在PCR反應抑制劑
優化建議：一般反應抑制劑多(duō)為(wèi)模闆帶入，可(kě)考慮重新(xīn)制備模闆或者稀釋模闆從而降低抑制劑水平；選擇反應性能(néng)強健、更耐受抑制劑 的試劑有(yǒu)助于減少此類因素影響；
可(kě)能(néng)的原因3
模闆擴增區(qū)域有(yǒu)複雜二級結構，高GC含量，影響擴增效率
優化建議：同一目标設計多(duō)個擴增區(qū)域/避開二級結構複雜的區(qū)域；選擇性能(néng)強健耐受性高的預混液，都是可(kě)行的解決方法。
03
PCR産(chǎn)物(wù)過長(cháng)影響擴增效率
優化建議：
縮短PCR産(chǎn)物(wù)長(cháng)度，控制在100 bp-150 bp之内
優化建議：
嘗試标準的三步擴增提高擴增效率
優化建議：
加長(cháng)延伸時間使得反應完全，以提高擴增産(chǎn)量
04
無Ct值
可(kě)能(néng)的原因1
循環數不夠
優化建議：一般反應設置為(wèi)40個，必要時可(kě)增加到45個循環；
可(kě)能(néng)的原因2
信号采集設置不當
優化建議：兩步擴增一般将信号采集設置在退火延伸階段，三步擴增程序應當将信号采集設置在72℃延伸階段。探針法通常在退火結束時或延伸結束時采集信号。
01
樣本重複性差
優化建議：
取材部位/處理(lǐ)方式/時間應嚴謹地保障一緻；選擇穩定可(kě)靠的試劑盒進行樣本制備（如RNA純化盡量選離心柱，帶去除gDNA的）、提取後對RNA的完整度和純度進行檢驗，減少樣本質(zhì)量重複性差。
02
技(jì )術重複性差
分(fēn)為(wèi)複孔重複性差（複孔之間ΔCt<0.5就算重複性良好），不同次跑的闆間重複性差。
排查方向有(yǒu)以下——
1
模闆濃度低容易出現複孔重複性差，若同時Ct值偏大，可(kě)嘗試提高模闆量。條件允許的話，增加複孔數，棄掉偏差大的值也好辦(bàn)法。
2
加樣誤差是同時影響孔間和闆間重複性的常見原因。良好的操作(zuò)習慣有(yǒu)助于提高實驗重複性，包括：定期校準加樣器能(néng)減少不同時期之間的加樣體(tǐ)積偏差；選擇預混液能(néng)減少加樣誤差影響孔間重複性；低吸附耗材能(néng)減少試劑挂壁；穩定的操作(zuò)環境溫度，反應前充分(fēn)混勻樣品和試劑和離心除氣泡避免影響讀數，都有(yǒu)助于減少孔間差異和闆間差異。注意儀器上不同位置的孔溫度一緻性也可(kě)能(néng)影響孔間一緻性。
3
試劑的配液穩定性也值得重視。有(yǒu)時候，配置好的反應闆不一定能(néng)馬上上機，等待時長(cháng)難以确定，導緻闆間誤差過大——若預混液能(néng)保持足夠長(cháng)時間的穩定性，可(kě)确定第一個檢測闆的結果與一個檢測闆的結果相匹配，同時還能(néng)提高工(gōng)作(zuò)流程的整體(tǐ)便利性。
4
試劑的批間一緻性是影響重複性、實驗前後可(kě)比較性的重要因素。定量PCR反應體(tǐ)積很(hěn)小(xiǎo)且靈敏度高，不同批次試劑的痕量偏差都可(kě)能(néng)影響結果穩定。盡量選擇同一批次/批号的試劑，選擇信譽可(kě)靠、批間一緻性高的産(chǎn)品，有(yǒu)助于提高實驗重複性和結果可(kě)比較性。
用(yòng)SYBR Green可(kě)以通過測熔解曲線(xiàn)來分(fēn)析确認反應産(chǎn)物(wù)特異性，熔解曲線(xiàn)是随溫度升高DNA雙螺旋結構解開程度的曲線(xiàn)：單尖峰提示産(chǎn)物(wù)隻有(yǒu)一種；多(duō)峰則提示有(yǒu)不止一個産(chǎn)物(wù)，比如引物(wù)二聚體(tǐ)或者非特異擴增。
排查方向有(yǒu)以下——
02
非特異擴增
排查特征：
電(diàn)泳檢測；雜峰Tm值在80℃之後，目标峰之後的多(duō)為(wèi)非特異擴增；
優化建議：
引物(wù)設計特異性不好或者模闆質(zhì)量不佳（如含有(yǒu)基因組污染）都可(kě)能(néng)導緻非特異擴增
——建議考慮重新(xīn)設計引物(wù)或者重新(xīn)制備模闆（記得在RNA純化中(zhōng)用(yòng)DNase處理(lǐ)降解gDNA）
另外，非特異擴增也可(kě)能(néng)來自反應退火開始前各種非特異延伸，和“實驗室某個角落or空氣中(zhōng)的前任、前前任qPCR” DNA污染！帶有(yǒu)UDG和dUTP配方設計的預混液可(kě)一步消除掉這類非特異産(chǎn)物(wù)；再加上抗體(tǐ)暫時封閉酶活的熱啓動設計，既能(néng)防止退火前的非特異反應，又(yòu)能(néng)在退火同時迅速釋放酶活，讓反應更快速高效率。
Tips:
1
熔解曲線(xiàn)不理(lǐ)想還可(kě)嘗試兩步法，因為(wèi)二步法擴增特異性高。
2
單峰Tm值在80℃之前考慮沒有(yǒu)模闆的可(kě)能(néng)性
3
單峰不尖要考慮可(kě)能(néng)有(yǒu)大小(xiǎo)接近的非特異擴增
4
Mg2+離子濃度超過3mM以上則易形成引物(wù)二聚體(tǐ)，選擇一管全包條件已優化的預混液就不用(yòng)考慮
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A
兼顧高靈敏度和高特異性：
保障檢測的特異性同時具(jù)有(yǒu)更小(xiǎo)的Ct 值，低檢出限5拷貝
B
高強度熒光信号：
更大的擴增曲線(xiàn)dRn值，更高的平台期熒光信号
C
寬動态範圍：
可(kě)在跨6個對數級動态範圍内進行精(jīng)準檢測，并确定可(kě)靠的線(xiàn)性
D
桌面穩定性高：
配置好的qPCR反應體(tǐ)系可(kě)以在室溫下穩定保存72小(xiǎo)時
E
批間一緻性高：
生産(chǎn)過程遵循ISO 9001質(zhì)量管理(lǐ)體(tǐ)系，保障數據的穩定性和重複性
F
抗殘留污染：
采用(yòng)UDG和dUTP配方，杜絕殘留擴增産(chǎn)物(wù)污染造成的假陽性結果
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